Vienas žymiausių mokslo žurnalų „Nature Methods“ organoidus – trimačius audinių modelius, leidžiančius studijuoti ir kurti žmogaus organus in vitro (mėgintuvėlyje), išrinko 2017 m. metodu. Tai buvo pripažinimas, kad 3D ląstelių struktūrų inspiruotas organoidų formavimo metodas – vienas reikšmingiausių 2017 m. mokslinių tyrimų metodų.

Metodas yra dar visai naujas ir turi nemažai trūkumų, tačiau kartu ir didžiulį potencialą žmogaus biologijos ir ligų tyrimų srityje. Jau šiandien galima numatyti, kad ilgas mokslo pažangos kelias, vedęs žmoniją nuo suvokimo, kad audiniai yra sudaryti iš ląstelių, ko gero, ateityje atves iki mėgintuvėliuose auginamų organoidų, kurie bus naudojami žmogaus organams gydyti ar net rekonstruoti. Ko gero, priartėsime net prie dirbtinio žmogaus, t. y. ne mąstančios būtybės – homo sapiens, bet žmogaus fiziologines funkcijas atliekančio organizmo, sukūrimo.

Laboratorijoje augančios ląstelės – kitokios

Pirmasis auginti ląsteles in vitro 1907 m. pradėjo Rossas Harrisonas, tyrinėdamas nervinių skaidulų susidarymą. R. Harrisonas iš varlės embriono išskyrė nediferencijuotas nervinio audinio ląsteles ir augino jas ant sterilios plokštelės kabančiame limfos laše, laikomame uždarytoje ir drėkinamoje kameroje. Šis metodas leido R. Harrisonui nuolat stebėti ląstelių augimą ir diferencijavimąsi. Tai buvo pirmasis eksperimentas, parodęs, kad ląstelės gali būti išskiriamos iš organizmo ir auginamos in vitro sąlygomis.

XX a. šeštajame dešimtmetyje ląstelės biologijos tyrimai ėmė sparčiai plėtotis. Mokslininkai išmoko auginti ląsteles ir su jomis atlikti tyrimus in vitro sąlygomis, todėl tyrimai tapo greitesni ir prieinamesni. 1951 m. George‘as Otto Gey‘us su bendradarbiais išgrynino pirmąją vėžinių ląstelių liniją, kuri buvo išskirta iš pacientės Henriettos Lacks, sirgusios gimdos kaklelio vėžiu. Ląstelių linija buvo pavadinta HeLa ląstelėmis jų donorės garbei. Ši ląstelių linija ne tik leido mokslininkams pasiekti proveržį ląstelės biologijos srityje, bet ir buvo labai svarbi dedant molekulinės biologijos pamatus.

Šiuo metu naudojami ląstelių auginimo protokolai yra gerai ištobulinti ir pritaikyti kiekvienai ląstelių linijai. Ląstelės paprastai yra auginamos specialiuose flakonuose, kartais Petri lėkštelėse. Naudojama sintetinė ląstelių mitybinė terpė, aprūpinanti jas maisto medžiagomis ir skatinanti jų augimą. Ląstelės yra auginamos inkubatoriuose, palaikant pastovią 37 ºC temperatūrą. Kiekviena ląstelių linija turi savo standartinį auginimo protokolą, todėl mokslininkams iš skirtingų laboratorijų yra lengviau gautus rezultatus palyginti.

Tačiau taip auginamos ląstelės labai skiriasi nuo tų, kurios yra gyvuose organizmuose. Ląstelės laboratorijose auginamos monosluoksniais, o jie neturi audiniams būdingos trimatės struktūros. Ląstelės nesudaro audiniams būdingų tarpląstelinių ryšių. Natūraliame audinyje augančios ląstelės yra apsuptos tarpląstelinio užpildo, kuris palaiko normalų ląstelių augimą, reguliuoja homeostazę ir ląstelių diferenciaciją. Be to, tarpląstelinis užpildas palaiko audinio struktūrą, suteikia ląstelėms mechaninę atramą, taip pat dalyvauja perduodant tarpląstelinius signalus. Auginant ląsteles in vitro, tarpląstelinis užpildas nesusidaro, dėl to iš esmės keičiasi ląstelių prisitvirtinimas prie paviršiaus ir tarpusavio bendravimas.

3D ląstelės – vaistų nuo vėžio tyrimams

Siekiant sukurti modelines sistemas, fiziologiškai artimas natūralioms biologinėms sistemoms, pradėtos auginti trimatės (3D) ląstelių kultūros. Pirmieji straipsniai, kuriose minimos 3D ląstelių kultūros, pasirodė prieš 27 metus. Mina J. Bissell savo ankstyvuosiuose darbuose iškėlė 3D ląstelių kultūrų auginimo svarbą kuriant patikimus biologinius modelius in vitro tyrimams.

Pastaruoju metu susidomėjimas 3D ląstelių kultūromis sparčiai auga, vis daugiau mokslininkų tyrimus atlieka ne su ląstelių monosluoksniais, o su trimatėmis struktūromis. 3D ląstelių kultūros gali būti naudojamos įvairiose tyrimų srityse. Onkologijoje 3D ląstelių kultūros gali būti naudojamos kaip avaskulinio naviko modeliai naujų vaistų tyrimams. Pastebėta, kad, priešingai nei ląstelių monosluoksniai, 3D ląstelių kultūros pasižymi atsparumu vaistams nuo vėžio. Taip pat 3D ląstelių kultūros gali būti naudojamos audinių formavimo ir auginimo ar fundamentaliems tyrimams, kuriuose svarbu atsižvelgti į ląstelių tarpusavio ryšius.

Šie įvairių mokslinių grupių tyrimai, sietini su taikymais onkologijos srityje, sudomino ir Lietuvos biofizikus. Kelerius metus jie laboratorijoje rinko informaciją apie 3D ląstelių kultūras – savitvarkes ląstelių kolonijų struktūras, susidarančias aplinkoje, kurioje sąveikos ląstelė–ląstelė dominuoja prieš sąveikas ląstelė–substratas. Per kelerius metus buvo išaugintos 3D ląstelių kultūros, kur kas artimesnės audiniams nei ląstelių monosluoksniai, ir atlikti pirmieji tyrimai (3 pav.).

3 pav. Ląstelių, augančių monosluoksnyje ir 3D sferoidinėje ląstelių kultūroje, palyginimas. Visos ląstelės augdamos monosluoksnyje kontaktuoja su mitybine terpe, todėl nanodalelės (raudona spalva) patenka į visas ląsteles. Tuo tarpu augdamos sferoide tik paviršinės ląstelės turi priėjimą prie mitybinės terpės, todėl ir nanodalelių susikaupimas matomas tik paviršinėse ląstelėse. Mėlynas branduolių dažas Hoecsht yra maža molekulė, todėl lengvai prasiskverbia į visas ląsteles abiem atvejais. Gretos Jarockytės nuotr.

Panaudojant trimatę vėžinių ląstelių kultūrą, galima modeliuoti, kaip įvairūs nanovaistai (vaistai, sukurti nanotechnologiniais metodais) patektų į navikines ląsteles. Jei tiriamos nanodalelės nesusikaupia vėžinėse ląstelėse, galima modifikuoti jų paviršių ir taip pagerinti nanodalelių patekimą į ląsteles. Anksčiau analogiški tyrimai buvo atliekami su ląstelių monosluoksniais, tačiau šiuo metu viso pasaulio mokslininkai vis dažniau pasitelkia trimačių ląstelių kultūrų modelius, kadangi jie kur kas geriau atkartoja in vivo navikus.

Nacionalinio vėžio instituto Biomedicininės fizikos laboratorijoje buvo atlikti tyrimai su trimatėmis ląstelių kultūromis, išaugintomis iš vėžinių ir kamieninių ląstelių. Panaudojant trimates ląstelių kultūras nustatyti nanodalelių prasiskverbimo į trimates ląstelių kultūras dėsningumai. Lyginamieji nanodarinių susikaupimo ir pasiskirstymo navikiniuose dariniuose, išaugintuose eksperimentiniuose gyvūnuose, tyrimai parodė, kad 3D ląstelių kultūros gali būti sėkmingai pritaikytos pagrindinių vaistų nuo vėžio efektyvumui ir gydomajam poveikiui vertinti gydant onkologinius pacientus. Panaudojant trimates ląstelių kultūras ir fluorescuojančius dažus, galima ištirti įvairių vaistų ir biologiškai aktyvių medžiagų judėjimą ir kaupimąsi audinį imituojančiose struktūrose ir numatyti, kaip šios medžiagos kaupiasi navikiniuose dariniuose.

Sunkiausia užauginti kaulinį ir širdies audinį

Nors 3D ląstelių kultūros savo sandara ir išsidėstymu artimesnės natūraliems audiniams nei ląstelių monosluoksniai, tačiau jos dar neatkartoja organų funkcijų. Siekiant atkartoti organų funkcijas imta auginti organoidus. Organoidai yra trimačiai daugialąsteliniai dariniai, auginami in vitro ir sukurti taip, kad kuo tiksliau atkartotų in vivo organus ir jų funkcijas. Tokie organoidai gali būti naudojami žmogaus biologijos tyrimams. Pagrindinis organoidų skirtumas nuo 3D ląstelių kultūrų yra tas, kad organoidai yra išauginami iš kamieninių ląstelių, dažniausiai iš pliuripotentinių (embriono arba indukuotų) arba iš suaugusio žmogaus audinių išskirtų kamieninių ląstelių. Pirmieji darbai su organoidais parodė, kad kamieninės ląstelės in vitro sąlygomis gali suformuoti sudėtingas struktūras, kurios yra stebėtinai panašios į in vivo organus. Per pastaruosius dešimt metų mokslininkai publikavo straipsnius, kuriuose organoidai buvo naudojami kaip įvairių organų (smegenų, tinklainės, virškinamojo trakto organų, inkstų, kepenų ir kt.) modeliai. Tačiau, kaip ir kiekvienas modelis, organoidai turi trūkumų. Pagrindinis trūkumas – kraujotakos nebuvimas, dėl kurio organoiduose susiformuoja negyvų ląstelių zonos. Mokslininkai vis dar bando patobulinti 3D ląstelių modelius, keisdami ląstelių mitybinės terpės sudėtį, modeliuodami ne visą organą, o tik jo dalį arba augindami kelis atskirus organoidus, kurie vėliau sujungiami į vieną organo modelį.

Terminas organoidai plačiai pradėtas vartoti po to, kai 2009 m. Hansas Cleversas pirmasis publikavo straipsnį, kuriame parodė, kaip išauginti mažus žarnyno organoidus iš suaugusio žmogaus išskirtų kamieninių ląstelių (4 pav.). H. Cleverso vadovaujama mokslininkų grupė įrodė, kad naudojant suaugusio žmogaus kamienines ląsteles galima išauginti tokius organoidus, kurie atkartotų kepenis, skrandį, plaučius, prostatą – beveik bet kurį organą, išskyrus kaulinį ir širdies audinį, kuriems susidaryti reikia embrioninių kamieninių ląstelių. Tokie in vitro išauginti organoidai gali būti perkelti į modelinius gyvūnus (atliekama transplantacija), kur įsitvirtina ir toliau auga. Tuo tarpu sveikos monosluoksnyje augusios ląstelės, suleistos modeliniams gyvūnams, ima formuoti navikus.

4 pav. Plonosios žarnos organoidas, išaugintas iš kamieninių ląstelių. Mėlyna spalva nudažyti ląstelių branduoliai, raudona spalva – baltymai kadherinai, žalia spalva – žarnyno bakterijos E. coli. Davido R. Hillo nuotr. „Nature Methods“, 2018, Nr. 15 (1), 19 p.

Smegenų organoidai – Zikos virusui tirti

H. Cleversas siūlo, kad panaudojant suaugusio žmogaus kamienines ląsteles būtų galima testuoti pacientui skiriamus vaistus. Šiuo metu minėta mokslininkų grupė daugiausia dėmesio skiria cistinės fibrozės tyrimams. Cistinė fibrozė – tai genetinių pakitimų sukelta liga, kurios priežastis – pakitusiose ląstelėse sintetinami netaisyklingi baltymai, neatliekantys savo funkcijos. Tokie baltymai sintetinami plaučiuose ir plonojoje žarnoje esančiose liaukose, dėl pakitimų jų sekretas pasidaro tirštas, klampus, galiausiai sutrinka organų praeinamumas ir funkcija. Cistinę fibrozę sukeliančios mutacijos būna labai įvairios, tačiau šiuo metu vartojami vaistai yra pritaikyti pacientams, kurie turi dažniausias mutacijas. H. Cleverso grupė siūlo panaudoti organoidus iš cistine fibroze sergančio paciento ląstelių tam, kad būtų ištirta, kuris medikamentas geriausiai veiktų konkrečiu atveju. Tą patį principą būtų galima pritaikyti ir gydant kitas genetines ligas.

Kitas svarbus organoidų pritaikymo aspektas – žmogaus embrionų vystymosi tyrimai. Galima sudaryti tokias in vitro sąlygas, kuriomis embrioninės kamieninės ląstelės formuotų organoidus tuo pačiu būdu, kuriuo formuojasi organai pradinėse žmogaus vystymosi stadijose. Šiuo metu daug dėmesio skiriama žmogaus smegenų tyrimams. Tačiau dėl akivaizdžių priežasčių žmogaus smegenų tyrinėti in vivo mokslininkai negali. Todėl Madeline Lancaster, siekdama sukurti smegenų modelį, iš embrioninių kamieninių ląstelių bandė išauginti dvimatę smegenų ląstelių populiaciją. Mokslininkė pastebėjo, kad išskirtos embrioninės ląstelės neprisikabina prie paviršiaus ir neformuoja monosluoksnio, kaip buvo tikėtasi. Užuot tai dariusios, ląstelės plaukiojo mitybinėje terpėje kaip maži kamuoliukai, o vėliau ėmė jungtis tarpusavyje ir save organizuoti. M. Lancaster nustatė, kad ląstelės formuoja mažas smegenis, kurios netgi turi atskirus smegenų regionus (5 pav).

Taip buvo pradėti auginti smegenų organoidai, kurie labai svarbūs smegenų vystymosi tyrimuose, taip pat leidžia tirti įvairius vystymosi sutrikimus, tokius kaip mikrocefalija (sumažėjusios galvos smegenys ir kaukolė). Gou-li Ming su grupe, panaudodami smegenų organoidus, tiria, kaip Zikos virusas pažeidžia smegenų vystymąsi ir sukelia mikrocefaliją besivystančioms smegenims. G. Ming užkrėsdavo skirtingos vystymosi stadijos organoidus Zikos virusu ir stebėdavo, kaip keičiasi organoido augimas. Pastebėta, kad virusu užkrėstų organoidų augimas smarkiai sumažėjo, pasikeitė jų struktūra.

5 pav. Smegenų organoidas, išaugintas iš indukuotų kamieninių ląstelių. Nervinės kamieninės ląstelės pažymėtos raudona spalva, neuronai – žalia spalva, mėlyna spalva nudažyti ląstelių branduoliai. Madeline Lancaster nuotr. „Nature Methods“, 2018, Nr. 15 (1), 20 p.

Regeneracinės medicinos laukia proveržis

Nors šiuo metu organoidai dažniausiai naudojami moksliniuose tyrimuose, tikimasi, kad ateityje įgytas žinias bus galima pritaikyti organams auginti laboratorijose ir juos panaudoti regeneracinėje medicinoje. Šiuo metu nemažai tyrimų atliekama ieškant, kaip gydyti trumposios žarnos sindromą ir žarnyno uždegimus naudojant plonosios žarnos organoidus. Tokios procedūros tikslas – atkurti pažeistos plonosios žarnos funkcijas. 2011 m. Jameso M. Wellso ir Jasono R. Spence‘o vadovaujami mokslininkai aprašė, kaip išauginti žmogaus plonosios žarnos organoidus iš pliuripotentinių kamieninių ląstelių. Ta pati mokslininkų grupė 2018 m. pademonstravo, kad in vitro išaugintus plonosios žarnos organoidus galima transplantuoti į imunodeficininių pelių organizmą ir jie sėkmingai prigyja. Tikimasi, kad ateityje, panaudojant organoidus, bus galima sėkmingai gydyti ligas, susijusias su plonosios žarnos nepakankamu išsivystymu ir funkcijų praradimu.

Organai iš trimačio spausdintuvo

Nuo organoidų žengiama tolyn organų auginimo laboratorijose link. Vienas žymiausių regeneracinės medicinos atstovų dr. Anthony Atala organus spausdina trimačiu spausdintuvu, vietoj rašalo naudodamas ląstelės ir tarpląstelinę medžiagą. Jo vadovaujama komanda jau dabar dirbtinai išaugina ir persodina pacientams šlapimo pūsles, atliekami klinikiniai tyrimai su kaulų, kremzlių, raumeninio audinio spausdinimu ir persodinimu, siekiama, kad persodinti audiniai turėtų visiškai išsivysčiusias kraujagysles ir nervus. Taip pat bandoma spausdinti ir kitus, kur kas sudėtingesnius, organus, tokius kaip inkstai, širdis. Tačiau kol kas šių organų auginimas dar tik eksperimentinėje stadijoje ir klinikoje nėra taikomas. Tikimasi, kad per ateinančius 5–10 metų ši technologija bus išplėtota tiek, kad paprastai ir greitai bus galima išspausdinti reikiamą organą donoro laukiantiems pacientams. Taip būtų išspręsta nuolatinė donoro organų trūkumo problema. Be to, tokie organai gali būti spausdinami panaudojant paciento ląsteles, todėl nebelieka organo atmetimo rizikos.

Vos prieš 100 metų žmonės išmoko auginti ląsteles in vitro. Tai davė stimulą didžiulei biologijos mokslo pažangai, kuri tebevyksta ir dabar. Pastaruoju metu stengiamasi priartinti ląstelių auginimo sąlygas prie realių, auginamos trimatės ląstelių kultūros, pradėti formuoti organoidai – mažos organų kopijos mėgintuvėliuose. Kartu pradėta ieškoti būdų, kaip išauginti organus, reikalingus transplantacijai. Šiuo metu laboratorijose persodinimui auginami paprastos sandaros organai, tačiau tikimasi, kad nepraėjus dešimtmečiui bus galima išauginti visus reikalingus organus. Lieka tik spėlioti, kiek laiko prireiks, kol žmogų tarsi robotą galėsime surinkti iš atskirų detalių.